Исследование гликозилирования парапротеинов и анализ их электрофоретической подвижности у больных множественной миеломой

Резюме. Работа посвящена изучению методом лектиноферментного анализа гликозилирования парапротеинов класса G у больных множественной миеломой. Выявлено, что исследуемые патологические иммуноглобулины по сравнению с контролем демонстрируют как более высокую, так и более низкую степень гликозилирования. Параллельно проводился анализ подвижности парапротеинов в диск-электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле. Установлена отрицательная корреляционная связь между уровнем взаимодействия парапротеинов с лектинами и длиной их электрофоретической миграции. Анализ гликозилирования поликлональных IgG у больных IgA-миеломой показал, что у большинства больных этот показатель снижен по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты позволяют более детально раскрыть возможные клинические последствия нарушения секреции парапротеинов и поликлональных иммуноглобулинов G.

Множественная миелома (ММ) относится к наиболее распространенным злокачественным заболеваниям системы крови, частота которой неуклонно повышается. Интерес клиницистов вызывает прежде всего вторичный иммунодефицит, как правило, развивающийся у большинства больных с этой патологией. Изучение структуры их сывороточных поликлональных иммуноглобулинов и парапротеинов, в частности олигосахаридных цепей молекул IgG , позволяет более детально представить не только тонкости секреции этих белков, но и оценить последствия этого процесса.

Исследование углеводных компонентов иммуноглобулинов человека с помощью лектинов — один из методов, позволяющих регистрировать и оценивать вклад олигосахаридной цепи в структуру и функции антител.

Уникальное свойство лектинов, описанное основателем лектинологии, доктором Яном Коцуреком, — это способность связываться с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов. Это позволяет широко использовать препараты лектинов в экспериментальной биологии и медицине (Игнатов В.В., 1997). Лектинофермент­ный анализ — простой и доступный метод анализа состава олигосахаридной цепи иммуноглобулинов (Калинин Н.Л., Кулякина М.Н., 1998). Ранее мы предложили вариант этой методики, позволивший выявить различное гликозилирование молекул IgG у пациентов с инфарктом миокарда и сахарным диабетом (Ушаков А.В. и соавт., 2005), а также уста­новить факт идентичности двух различных парапротеинов у больного ММ (Ильясов Р.К. и соавт., 2006).

Имеющиеся в настоящее время данные литературы позволяют говорить о наличии при ММ моноклоновых B -лимфоцитов — предшественников опухолевых плазмоцитов. Поскольку опухолевые детерминанты выявлены на всех этапах дифференцировки B -лимфопоэза, следовательно, опухолевая трансформация при ММ происходит в отделе предшественников с возможностью «вызревания» в пределах опухолевого клона до миеломной клетки. Поэтому факт существования различных фенотипов B -лимфоцитов опухолевого клона скорее всего обусловлен остановкой роста на различных этапах B -клеточной дифференцировки. Это сопровождается накоплением клеток конкретной фенотипической характеристики и позволяет многим авторам рассматривать ММ как дифференцирующуюся ­ B -клеточную опухоль (Голенков А.К., Шабалин В.Н., 1995; Мошинская О.В., 1998). Учитывая, что различные фазы секреции иммуноглобулинов сопровождаются поэтапным присоединением углеводов для формирования полноценных олигосахаридных компонентов тяжелых и легких цепей (Литмен Г., Гуд Р., 1981), можно предположить, что прекращение синтеза полипептидной цепи на разных этапах ее сборки сопровождается также различной неполнотой формирования углеводных цепей.

Данных литературы, касающихся гликозилирования иммуноглобулинов при ММ, недостаточно. Тем не менее они позволяют понять общие тенденции этого процесса. То, что различные образцы миеломных IgG отличаются друг от друга своей неполнотой формирования углеводной цепи, было установлено сравнительно недавно ( Mizuochi T . ­ et al ., 1982). Анализ электрофоретической подвижности иммуноглобулинов позволил выяснить, что молекулы IgG , богатые сиаловой кислотой, более подвижны, однако прямой зависимости между изменением заряда молекулы и присутствием сиаловой кислоты не выявлено (Готтшлак А., 1969). Группой авторов у больных миеломой выявлены на Fab -фрагментах IgG участки повышенного сиалирования и фукозилирования ( Kinoshita N . et al ., 1991). Другие исследователи предлагают рассматривать повышение сиалирования IgG как маркер малигнизации парапротеинемий ( Fleming S . C . et al ., 1998). Интересна публикация, описывающая отличие гликозилирования легких цепей парапротеинов при ММ; эти иммуноглобулины отличались также по электрофоретической подвижности ( Goni F . ­ et al ., 1988). В одной из работ лектиноферментным методом проводился сравнительный анализ гликозилирования Fab — и Fc -фрагментов молекулы IgG у больных ММ; выявлено, что Fab -фрагменты наиболее гликозилированы с преобладанием фукозы, галактозы и сиаловой кислоты ( Hajdukovic — Dragojlovic L . et al ., 1997). Факты гликозилирования гипервариабельных областей иммуноглобулинов представляются нам более интересными, так как именно эти участки определяют конфигурацию антигенсвязывающего участка и его комплементарность конкретной антигенной детерминанте (Андреева Н.Е., Чернохвостова Е.В., 1985).

Поликлональный IgG — это пул гетерогенных иммуноглобулинов, отличающихся множеством признаков: специфичностью, антигенными свойствами, молекулярным весом и зарядом. Два последних фактора являются определяющими в регуляции подвижности белков в электрическом поле. Извест­но, что изоэлектрическая точка ( pI ) нормальных, поликлональных иммуноглобулинов класса G находится в диапазоне от 5 до 8,5. Множество молекул IgG можно разделить на две группы иммуноглобулинов с различными подфракциями Fab -фрагмента, мигрирующие во время электрофореза к аноду также по-разному: более «мобильные», кислые и более «медленные», щелочные. Большинство парапротеинов имеют pI выше 7 (Кирюхина Д.Н., Кирюхин И.Ф., 1974; Блумберга И.А., 1976).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены результаты исследований 40 больных ММ, проходящих лечение в отделении гематологии Крымского республиканского клинического онкологического диспансера. Из них 29 больных с парапротеином класса IgG и 11 — класса IgA. Все пациенты имели в той или иной степени выраженности классические проявления этой болезни: гиперпротеинемия, протеинурия, остеодеструкция, высокая СОЭ и плазмоцитоз. Пробы крови брались натощак из периферической вены в первые сутки поступления в клинику. В исследование не включались больные с сопутствую­щей патологией, чтобы исключить другие факторы, влияющие на иммунную си­стему.

Исследование сыворотки крови больных на наличие М-градиента проводили методом электрофореза и иммуноэлектрофореза в геле агара (Фримель Г., 1987). Гель агара (1,3%) готовился на 0,103 М трис-боратном буферном растворе, pH 9,2. В качестве контроля использовали сыворотку крови здорового человека и больного ММ с выраженной парапротеинемией.

Парапротеины и поликлональная фракция IgG из сыворотки крови больных ММ, а также препарат IgG из смеси сывороток крови здоровых людей были получены следующим образом. Осадок фракции глобулинов, полученной высаливанием 17,5% (NH 4 ) 2 SO 4 , отделялся центрифугированием (6000 g,­ 30 мин), затем был растворен в 0,005 М фосфатном буферном растворе, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,4 ( PBS ) и диализован против 0,025 М трис-НCl буферного раствора, содержащего 0,035 М NaCl, рН 8,8. Элюцию проб IgG осуществляли с помощью того же буферного раствора методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Трисакриле М (LKB, Швеция). Профиль элюции строили по значениям экстинкции собираемых проб при длине волны 280 нм. Измерение экстинкции проводили на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, СССР). Контроль чистоты выделенных парапротеинов и анализ их подвижности осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном на 0,001 М трис-глициновом буферном растворе, pH 8,3. Сравнительная оценка подвижности парапротеинов, основанная исключительно на анализе их молекулярной массы, проводилась методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (3,5–30%) в присутствии додецилсульфата натрия (Гааль Э. и соавт., 1982).

В качестве относительной величины электрофоретической подвижности парапротеинов в 7,5% ПААГ ( l ) взято отношение миграции парапротеина к подвижности альбуминовой фракции поликлонального IgG . При этом длина пробега учитывалась как расстояние от края лунки до среднеарифметической точки между ближним и дальним краями электрофоретического пятна того или иного белка (рис. 1).

Рис. 1. Диск-электрофорез в 7,5% полиакриламидном геле. 1 — контрольная сыворотка; 2–13 — парапротеины больных ММ

Класс парапротеинов и тип легких цепей определяли методами иммуноэлектрофореза (Грабар П., Буртэн П., 1963) и двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РИД) (Фридберг Ч.К., 1975) с использованием овечьих поликлональных моноспецифических антисывороток против IgG (H+L), IgG (H), IgA (H), IgM (H), а также против λ- и κ-цепей иммуноглобулинов человека (НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ, г. Нижний Новгород).

Степень взаимодействия лектинов с углеводными компонентами IgG оценивали нашим вариантом лектиноферментного анализа. На поверхность 96-луночного планшета (C ostar , США) вносились (по 100 мкл в лунку) препараты исследуемых иммуноглобулинов в концентрации 1 мкг/мл в 0,05 М Nа-бикарбонатном буфере, рН 9,2. После тщательной промывки водой проводилась трехразовая (по 10 мин каждый раз) промывка лунок планшета 200 мкл раствора, содержащего 3,75 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Serva, Германия) в PBST (PBS, содержащий 0,025% твин 20 (Serva, Германия)): BSA+PBST. На следующем этапе вносили по 50 мкл раствора лектина гороха, конъюгированного с пероксидазой хрена (Лектинотест, Украина) в подобранном рабочем разведении в 0,003 М фосфатном буфере с 0,14 М NaCl и 0,003 М KCl, pH 7,4. Инкубацию лектина проводили в течение 1 ч при +37 °С. После стандартной промывки BSA+PBST в лунки вносили по 100 мкл субстратной смеси: 0,2 мМ ABTS (2, 2’-азино-ди-[3-этил-бензтиазолинсульфонат (6)]) в 0,05 М Na-цитратном буферном растворе, рН 4,0, содержащем 0,01% перекись водорода. Результат учитывали на спектрофотометре Multiskan (Titertek, Финляндия) при длине волны 405 нм. При этом рассматривались только данные тех рядов, в которых контрольные лунки демонстрировали минимальную оптическую плотность — от 0,03 до 0,085.

В данной работе преимущественно использовался лектин гороха, имеющий, как известно, высокое сродство к α- D -маннозе.

Относительная степень гликозилирования парапротеинов (∆ E ) оценивалась как разность экстинкций конечного раствора в ЛФА при взаимодействии с лектином гороха исследуемого парапротеина и контрольного поликлонального IgG , выделенного из смеси сывороток пятидесяти здоровых людей.

Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ Microsoft Excel (Windows XP). Данные в таблицах представлены в виде M ± m , в диаграммах — M ±σ. Различия оценивались по критерию Стьюдента (t) и считались достоверными при р<0,05. Анализ зависимости подвижности парапротеинов в электрическом поле и экстинкции конечного раствора в ЛФА (как критерий степени взаимодействия IgG с лектином гороха) проводился с учетом критических значений коэфицентов корреляции рангов ( p ) Спир­мена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ легких цепей методом РИД парапротеинов в группе больных IgG-миеломой показал, что у 17 больных этот патологический иммуноглобулин относился к классу IgG-κ, а у 12 — IgG-λ.

Результаты взаимодействия исследуемых парапротеинов IgG с лектином гороха позволили получить такое распределение: 10 парапротеинов демонстрировали более высокую по сравнению с контролем степень подобного взаимодействия, 19 парапротеинов — более низкую (рис. 2, табл. 1 и 2). При этом было замечено, что белки первой группы обладали большей электрофоретической подвижностью, чем второй.

Рис. 2. Взаимодействие лектина гороха с IgG здоровых людей (Дон, белый столбик) и IgG-парапротеинами больных ММ (серые столбики). Данные лектиноферментного анализа. Е 405 — экстинкция при длине волны 405 нм

Коэффициент ранговой корреляции между l и ∆E составил –0,59. При ошибке рангового коэффицента m=0,15 критерий Стьюдента (t) составил 3,67, что по таблице критических значений соответствует точности статистической достоверности выше 99% (р<0,01). Итак, между вышеуказанными параметрами — электрофоретической подвижностью и степенью взаимодействия с лектином гороха — выявлена отрицательная обратная корреляционная связь. На рис. 3 видно, что повышение показате­­­­­ля l ­сопровождается снижением ∆E.